成都2023年6月28日 /美通社/ -- 成都康華生物制品股份有限公司（簡稱：康華生物）全資子公司康華動保（成都）生物科技有限公司（簡稱:康華動保）和杭州佑本動物疫苗有限公司（簡稱:杭州佑本）技術合作，共同打造了一款用于預防寵物狂犬病的產品 -- 希利斯。

狂犬病是一種致死性傳染病，所有溫血動物包括人類均可感染，感染后的結局為100%死亡?？袢〉淖阚E遍布全球150多個國家和地區，據WHO數據顯示，狂犬病每年可造成全球6萬左右人類死亡，對人類及動物生命、社會資源及國家公共衛生體系構成嚴重威脅^[1、2]。

狂犬病的最早文字記載見于公元前23世紀的埃什努納（現伊拉克）法典，該法典規定了主人看管不當致使犬傷致死所應承擔的責任。中國早在2500多年前就有狂犬病犬的存在，我國關于狂犬病的記載最早見于《左傳》“（魯）襄公十七年十一月甲午國人逐瘈狗。”其中的“瘈”即瘋之意^[5]。

在人類對狂犬病認識的過程中，最具有里程碑意義的工作當屬19世紀80年代法國科學家路易斯·巴斯德等人的重大發現。巴斯德發現了腦組織（和脊髓）是患者體內病毒所在位置，并證明將病毒注射至腦內后，可以致使感染動物的麻痹和死亡，并認識到連續腦內接種可用于病毒傳代。同時，巴斯德及其同事，通過在犬腦硬膜下接種和在家兔腦內連續傳代的方法，使街毒變成了固定毒。1885年，巴斯德等人利用固定毒，成功制備了疫苗，從此開啟了狂犬病預防的新時代 ^[5、6] 現今成熟應用于狂犬病預防的狂犬病疫苗毒株PM株、PV株，均源自于巴斯德株。

狂犬病疫苗生產用細胞培養技術，主要有轉瓶培養、細胞工廠培養和生物反應器懸浮培養等。傳統的細胞培養工藝如轉瓶、細胞工廠等，存在細胞培養過程中外源蛋白污染及產品批次內與批次間不穩定等因素，目前，利用生物反應器實現細胞的大規模培養來生產狂犬病疫苗已成為最普遍的技術，較傳統的狂犬病疫苗生產工藝有很大的提升，有效保證了產品批次的穩定性，其中利用生物反應器進行全懸浮細胞大規模培養制備抗原液，更是目前生產寵物狂犬病滅活疫苗最先進的工藝^[3、7-8]。

另外，傳統的狂犬病疫苗生產工藝（轉瓶培養、細胞工廠等），在產能及異源蛋白去除方面參差不齊。且我國用于動物的狂犬病疫苗研究及推廣技術，明顯落后于人用狂犬病疫苗，在動物免疫上存在很多不規范問題^[9-10]?，F代生物技術的發展，也在不斷推動獸醫生物制品制造工藝的新突破，漸漸地，人們也從重點關注疫苗的免疫效力轉移到了對不良反應的關注，在這一過程中，“純化”工藝在現代工業生產中具有極致的魅力^[11]。分離純化工程技術，也成為了決定獸用物制品純度、效力、質量安全水平的關鍵因素^[12]。

2014年，成都康華生物制品股份有限公司（以下簡稱：康華生物）生產的“凍干人用狂犬病疫苗(人二倍體細胞)”，商品名:HDCV上市，標志著中國狂犬病疫苗迎來了“人源”時代。康華生物HDCV產品安全性好，適合全人群，且免疫持久性長達10年^[4]。

希利斯是康華生物全資子公司康華動保（成都）生物科技有限公司（以下簡稱：康華動保）和杭州佑本動物疫苗有限公司共同技術合作的一款用于預防寵物狂犬病的產品，創新引用人狂犬病滅活疫苗生產技術-層析純化，有效去除大分子物質，以及過濾難以去除的蛋白成分和小分子物質，實現病毒蛋白高度純化，是市面上首個采用層析純化技術的寵物精制狂犬病疫苗。

那么，疫苗具備什么樣的特點才能被判定為精制苗，要從以下指標來看：（1）抗原含量（2）穩定性（3）純度（4）臨床副反應（5）免疫效果。

以下為希利斯的相關數據。

一、抗原含量

根據《獸用生物制品生產與檢驗報告》^[13]數據顯示，隨機抽取的4個連續批次希利斯產品成品效力均在6 IU/dose以上（平均值為6.975 IU），遠高于WHO規定的質量標準（大于等于1IU），見表1。

二、穩定

希利斯采用全懸浮技術進行細胞培養（圖1），為數字化可控系統，全程精準監控、調整細胞培養、病毒繁殖過程中的各項工藝參數，合理選擇細胞接毒時機，完美控制病毒培養狀態，這是單位體積培養液中抗原含量高、產品批次內/間差異小的決定性因素，進而有效的保證了產品質量穩定可控。

另希利斯的保存期研究實驗結果表明，實驗疫苗在37攝氏度存放15、30天，2-8攝氏度保存3、6、9、12、18、24、27個月，其外觀性狀、無菌、安全、效力、異常毒性和內毒素等各項檢驗都符合《犬狂犬病滅活疫苗（PV/BHK-21株）質量標準規定要求，證明疫苗可在37攝氏度保存30天，在 2-8攝氏度保存27個月，產品質量穩定可靠^[14]。

三、純度

由于采用了生物反應器全懸浮大規模培養技術，單位體積培養液中的抗原含量是常規的轉瓶培養、細胞工廠培養、微載體懸浮培養方式制備的抗原含量5~10倍，高濃度的抗原是保證后期進行純化的基礎。選取疫苗生產過程中病毒滅活后的濃縮樣本及層析純化樣本進行電鏡觀察，檢測病毒粒子的濃縮與純化效果。電鏡觀察顯示，濃縮樣本病毒粒子相對較多，聚集成堆，見圖2-A。再經層析純化后疫苗中的病毒粒子進一步富集，純度較高，見圖2-B。

為了解濃縮和層析純化后樣本中狂犬病病毒蛋白純度，對濃縮樣本及層析樣本進行SDS-PAGE電泳檢測，見圖2-C。泳道1-3分別為希利斯20220201批， 6倍稀釋的濃縮樣本、 1#層析樣本、 2#層析樣本。結果可見清晰的與理論上狂犬病病毒結構蛋白份分子量大小符合的條帶（G蛋白，約67kDa；N蛋白，約55kDa；M1蛋白，約38kDa；M2蛋白，約26kDa；），經過純化后的樣本，與狂犬病病毒結構蛋白分子質量大小不符的條帶幾乎不可見；可見，疫苗中雜蛋白去除率高達99.9%。電鏡和電泳結果充分地證明了希利斯產品中病毒抗原粒子完整，并且抗原液得到了良好的濃縮和純化，這是疫苗有效性和安全性的有力保證。

注：A. 濃縮樣本電鏡觀察結果（×20K）；B.層析純化樣本電鏡觀察結果（×70K）；C.濃縮及層析樣本SDS-PAGE電泳圖

四、臨床副反應

《犬狂犬病滅活疫苗（PV-BHK-21株）安全性研究報告》^[15]數據顯示，通過用3批實驗室制備的希利斯進行的各項安全性試驗，試驗內容包括：對最小使用日齡（3月齡）比格犬，一次單劑量接種的安全性試驗、單劑量重復接種試驗、一次超劑量接種試驗、對妊娠犬的安全性和生產性能影響試驗以及對不同品種犬（如京巴犬、沙皮犬等）的安全性試驗，結果表明，所有試驗動物未出現明顯的局部和全身的反應，對妊娠犬安全且其生產性能不受影響，接種疫苗的豚鼠和小鼠未出現異常。

2022年5月22日康華動保啟動的《希利斯臨床數據研究試驗》數據顯示^[16], 對200多只試驗所涉及的犬只品種（比格犬、泰迪、約克夏、法斗、吉娃娃、柯基、西高地、貴賓、中華田園犬、冠毛犬）進行疫苗免疫后臨床不良反應觀察，希利斯針對試驗犬免疫，試驗犬均無不良反應發生。

六、免疫效果

根據《希利斯臨床數據研究試驗》數據^[16],試驗犬所設計品種及其幼齡犬、老齡犬均能產生有效的狂犬病病毒中和抗體，免疫成功率為100%，結合《希利斯臨床數據研究試驗》及《狂犬病滅活疫苗（PV/BHK-21株）免疫產生期和免疫持續期的研究報告》^[17]數據顯示，試驗犬在免疫后7天以后均能測到保護性抗體，抗體水平在21天左右到達高峰，之后逐漸下降，至12個月時，抗體水平仍遠大于最低保護量0.5 IU，在1.0 IU以上，見圖3-A、3-B。以上研發及臨床試驗結果表明，希利斯能誘導犬產生良好的免疫應答，免疫效果持久。

注：A.《狂犬病滅活疫苗(PV/BHK-21株)免疫產生期和免疫持續期的研究報告》；B.《希利斯臨床數據研究試驗》

綜上所述，經過鏈接人用狂犬病滅活疫苗生產-層析純化技術的希利斯，高效、安全、穩定、臨床副反應低，免疫效果持久，這是更高標準的寵物疫苗。希利斯，開啟寵物精制苗時代。